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实验专栏丨你要的慢病毒转染实验技能都在这了!

2019年01月05日 热度:921 ℃

细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染(永久转染)两大类。本实验室主要是质粒转染、miRcroRNA转染、慢病毒转染、药物转染、多肽转染等。

(请耐心花2分钟阅读完本文,建议推荐给小伙伴一起学)

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实验材料及试剂

24孔板、CO2培养箱、酒精灯等;无血清培养基、MEM-α或DMEM、polybrene、慢病毒等。

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实验内容

一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法

1、慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以2*10^5/孔铺到6孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为4*10^5/孔左右。

2、第二天,用含有0.5ug/mL polybrene的2mL新鲜培养基替换原培养基,加入适量病毒悬液。37℃孵育。

3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤) 4小时后加入2mL新鲜培养基以稀释polybrene。

4、继续培养24小时,用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白,一般转染48小时后可见明显荧光表达,72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率,可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选,可以在转染3-4天后开始加药。

二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法

1、在2×105个/ml悬浮细胞中加入polybrene至0.5ug/mL和适量病毒,充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作,部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。

2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤) 4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。

3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。

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注意事项

1、病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风扇。病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。

2、操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请于84消毒液或1%SDS 中浸泡过夜后弃。

3、用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用70%乙醇清理显微镜实验台。

4、如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽量使用组织培养室内的离心机。

5、脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。

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